适用场景
分子克隆做单酶切、双酶切、PCR 产物酶切验证或甲基化分析时，需要快速确认限制性内切酶的识别位点、推荐缓冲液、甲基化敏感性和双酶切兼容性。
本表覆盖常规克隆最常用的 II 型限制性内切酶，适合在酶切方案设计、双酶切缓冲液选择和诊断“切不开”“双酶切失败”时直接查阅。
参数速查表
酶
识别位点 (5′→3′)
推荐缓冲液
甲基化敏感
最适温度
双酶切兼容性
EcoRI
G/AATTC
CutSmart
敏感 (Dam、Dcm 阻断)
37 °C
与 BamHI、XhoI、NdeI 兼容
BamHI
G/GATCC
CutSmart
部分敏感 (Dcm)
37 °C
与 EcoRI、HindIII、XbaI 兼容
HindIII
A/AGCTT
rCutSmart
阻断 (Dam)
37 °C
与 EcoRI、BamHI、KpnI 兼容
XhoI
C/TCGAG
rCutSmart
敏感 (CpG)
37 °C
与 EcoRI、NotI、XbaI 兼容
NdeI
CA/TATG
CutSmart
敏感 (Dam)
37 °C
与 EcoRI、XhoI、NotI 兼容
NotI
GC/GGCCGC
CutSmart
敏感 (CpG、Dam)
37 °C
与 XhoI、NdeI、XbaI 兼容
XbaI
T/CTAGA
CutSmart
敏感 (Dam、Dcm)
37 °C
与 EcoRI、XhoI、NdeI 兼容
KpnI
GGTAC/C
CutSmart
敏感 (Dcm)
37 °C
与 BamHI、HindIII 兼容
DpnI
GmATC
CutSmart
仅切甲基化 (Dam)
37 °C
仅识别 Gm6ATC，定点突变去除模板用
BglII
A/GATCT
rCutSmart
敏感 (Dcm)
37 °C
与 NdeI、XhoI、NotI 兼容
SalI
G/TCGAC
rCutSmart
敏感 (CpG)
37 °C
与 XhoI、NotI、NdeI 兼容
PstI
CTGCA/G
CutSmart
敏感 (Dcm)
37 °C
与 EcoRI、BamHI、HindIII 兼容
使用注意
表中所列缓冲液为 NEB 体系（CutSmart / rCutSmart）。若使用 Thermo FastDigest、Takara 或其他厂家酶，缓冲液名称和兼容性不同，必须改用对应厂家的双酶切兼容表，不要跨体系混用。
“甲基化敏感”列中 Dam、Dcm 指大肠杆菌常见的 DNA 甲基化修饰；若 PCR 产物或甲基化缺失菌株（如 GM2163、JM110）提取的质粒上无这些修饰，则不受影响。
DpnI 仅切割 Gm6ATC（即 Dam 甲基化的 GATC），是定点突变实验中去除未突变亲代模板的标准工具酶；未甲基化的 GATC 不被切割。
双酶切时优先选 1× CutSmart 缓冲液，目前 NEB 大多数内切酶在 CutSmart 中活性 ≥75%；若两酶在 CutSmart 中均低活，再用 NEB DoubleDigest Calculator 计算最优缓冲液。
不同酶的最适温度几乎都是 37 °C，但少数例外（如 BclI 需 50 °C、SmaI 推荐 25 °C），双酶切时需同时满足两酶温度要求，否则分段孵育。
酶切反应中甘油浓度应 ≤5%，否则会出现星号活性（star activity）。浓储酶液（5×–10×）每次反应加入体积不超过总体积 1/10。
长时间酶切（>1 h）或过量酶（>10 U/μg DNA）也容易诱发星号活性，常规质粒酶切 1 μg DNA 用 5–10 U 酶、37 °C 1 h 足够。
双酶切若两酶识别位点距离过近（<10 bp），近端酶切割效率会下降，建议分步酶切或延长第二轮孵育时间。
常见问题
双酶切总是切不开一个位点，是缓冲液选错了吗？
最常见原因是缓冲液对其中一种酶活性偏低。NEB 体系下优先用 1× CutSmart 通用缓冲液，多数酶在此缓冲液中活性 ≥75%。
若仍切不开，先单独跑单酶切确认每个酶在所选缓冲液中是否有活性，再用 NEB DoubleDigest Calculator 复核。也可能是识别位点被 Dam/Dcm 甲基化阻断——若 DNA 来自常规 dh5α，则受甲基化敏感的酶（如 XbaI、ClaI）会失活，需用甲基化缺失菌株或 PCR 产物。详见 限制性内切酶切不开的常见原因。
DpnI 能切未甲基化的质粒吗？
不能。DpnI 仅识别并切割 Gm6ATC（Dam 甲基化的 GATC 位点）。
从常规大肠杆菌（如 DH5α）提取的质粒带有 Dam 甲基化，可被 DpnI 切；PCR 产物未甲基化，DpnI 不切割。定点突变实验正是利用这一点，用 DpnI 选择性降解亲代甲基化模板、保留未甲基化的突变 PCR 产物。
同一缓冲液里两种酶都 ≤50% 活性怎么办？
按以下顺序处理：①先用活性较低的酶切 1 h，补加少量第二种酶继续切 1 h（同缓冲液分步）；
②若两酶温度不同（如 25 °C / 37 °C），先低温酶切后高温酶切，中间不需纯化；③若缓冲液实在不兼容，分两管分别酶切、中间用 PCR 纯化柱回收再切第二个酶。最稳妥的做法是提前在设计克隆位点时优先选 CutSmart 全兼容的酶组合。
星号活性（star activity）是什么？怎么避免？
星号活性指酶在非理想条件下识别并切割与识别位点相似的序列，造成非特异切割。常见诱因：甘油浓度过高（>5%）、酶量过大、孵育时间过长、缓冲液 pH 或离子强度偏低、含有机溶剂。
避免方法：酶加入量 ≤10 U/μg DNA、反应总体积 ≥20 μL、甘油体积 ≤5%、孵育时间 ≤1 h、使用高保真版本酶（如 NEB 的 HF 系列）。
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